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優(yōu)康森醫(yī)療科技(重慶)有限公司
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臨床產(chǎn)品轉(zhuǎn)化
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ICSI冷凍技術(shù)

2024-04-08

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人類卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術(shù)開(kāi)展至今已有30余年。其最初主要應(yīng)用于針對(duì)嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥導(dǎo)致的男性不育患者的治療,但隨著未成熟卵體外培養(yǎng)、卵子冷凍、胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)等輔助生殖技術(shù)的開(kāi)展, ICSI使用比例已大幅提升。雖然目前ICSI技術(shù)相對(duì)成熟,但仍有很多細(xì)節(jié)值得關(guān)注和完善。為規(guī)范與優(yōu)化人類輔助生殖技術(shù)從業(yè)者的ICSI操作,由中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)發(fā)起,并聯(lián)合全國(guó)多家生殖醫(yī)學(xué)中心共同編撰了本共識(shí)。



01 ICSI的適應(yīng)證


01. 男性因素


① 極重度少精子癥及弱精子癥,即精子濃度<1×106/mL 及精子前向運(yùn)動(dòng)百分率<1%,處理后的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)不足 100 萬(wàn)。

② 特殊類型畸形精子癥,如圓頭精子癥、大頭精子癥、無(wú)頭精子癥及精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常。

③ 精子功能異常。

④ 射精功能障礙。

⑤ 精子免疫性因素。


02. 非男性因素


① 需行 PGT 周期;

② IVM 周期;

③ 卵子凍融周期;

④ 不明原因前次常規(guī)IVF周期完全受精失??;

⑤ 前次周期卵子普遍存在透明帶異常。


應(yīng)將ICSI作為上述男性與非男性因素的授精方式。對(duì)于常規(guī) IVF 授精有污染史且未能抗菌治愈的病例,仍然存在再次 IVF授精污染風(fēng)險(xiǎn),可嘗試選擇ICSI。



02 ICSI周期中正常及常見(jiàn)異常形態(tài)卵子


通常情況下,僅對(duì)出現(xiàn)第一極體(Pb1)的核成熟卵子進(jìn)行 ICSI 授精。本共識(shí)整理了正常及常見(jiàn)異常形態(tài)的卵子以作參考,詳見(jiàn)圖1。



注:COC示卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物;Pb1示第一極體;ZP示透明帶;PVS示卵周間隙

圖1 人類正常及常見(jiàn)異常卵子


A示COC(成熟卵子,卵丘細(xì)胞松散,箭頭所示為Pb1);B示COC(未成熟卵子,卵丘細(xì)胞致密,未見(jiàn)Pb1);C示COC(退化卵子且透明帶破裂);D示正常形態(tài)卵子;E示偏振光顯微鏡下正常形態(tài)卵子,紡錘體(箭頭所示)位于極體正下方;F示MⅠ卵子;G示GV卵子;H示胞質(zhì)粗糙,顆粒感明顯且均勻;I示胞質(zhì)可見(jiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇,光滑似圓盤;J示胞質(zhì)多發(fā)空泡(呈凹陷感,最大空泡直徑約16 μm,箭頭所示);K示胞質(zhì)細(xì)胞器聚集,中央?yún)^(qū)域顆粒感明顯;L示異常ZP,呈瓊脂/蠟樣、無(wú)PVS、胞質(zhì)出現(xiàn)折光體(箭頭所示,約5 μm);M示異常ZP,邊緣呈鋸齒狀,Pb1呈月牙狀(箭頭所示),無(wú)PVS;N示ZP增厚(>20 μm為增厚);O示ZP著色,透明度下降(箭頭所示卵子);P示PVS增大(至少可以容納2個(gè)正常大小的Pb1);Q示ZP夾層(箭頭所示);R示PVS內(nèi)大量顆粒碎片;S示巨大Pb1(長(zhǎng)徑約80μm);T示多Pb1且較大;U示Pb1碎片化且PVS增大;V示連體卵子;W示胞膜不規(guī)則;X示巨大卵子(箭頭所示,總體平均直徑約230 μm,胞質(zhì)平均直徑約150μm),雙Pb1,胞質(zhì)細(xì)胞器聚集;Y示長(zhǎng)橢圓形巨大卵子;滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇(SERc)、大空泡(直徑>14 μm)或多發(fā)小空泡、胞質(zhì)細(xì)胞器聚集、鋸齒或蠟樣透明帶以及多重異常形態(tài)卵子會(huì)對(duì)受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局產(chǎn)生較大的負(fù)面影響,但部分卵子通過(guò)ICSI仍然可以獲得健康活產(chǎn)嬰兒,因此建議這部分卵子進(jìn)行特殊標(biāo)記并不作為移植選擇。


03 卵子的顯微注射


01. 顯微操作系統(tǒng)


顯微操作系統(tǒng)應(yīng)安置在百級(jí)凈化區(qū)域(ISO Class5),該區(qū)域應(yīng)相對(duì)獨(dú)立、安靜且人員流動(dòng)較小,遠(yuǎn)離門口和傳遞窗口,盡量避免高效濾器出風(fēng)口直吹操作臺(tái)面和操作人員,這樣可以保障操作環(huán)境穩(wěn)定,使操作人員免受外界因素干擾而更加專注。除此之外,與顯微操作相關(guān)的培養(yǎng)箱應(yīng)盡量靠近顯微操作設(shè)備,增加操作流程的順暢度,減少配子或胚胎在外界暴露的時(shí)間。


02. ICSI操作皿的制備


ICSI操作皿各類微滴的具體布局沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),可根據(jù)個(gè)人操作習(xí)慣制備,但應(yīng)遵循如下基本原則及參考技巧:①操作液微滴應(yīng)盡量集中于皿的中部,以避免操作針下降時(shí)觸碰皿的側(cè)壁;②如果是極重度少、弱精或睪丸/附睪精子,也可不用制作PVP微滴,直接將精子懸液制成微滴;③建議雙人制皿,及時(shí)覆蓋培養(yǎng)油,避免因揮發(fā)而改變液滴滲透壓。



03. 顯微操作針的安裝


① 安裝時(shí)避免注射針內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡;

② 操作針在插入持針器過(guò)程中如遇到較大阻力時(shí)切勿強(qiáng)行插入,應(yīng)檢查持針器管路內(nèi)是否有破損的玻璃殘留物;

③ 若發(fā)現(xiàn)操作針吹吸不順暢,尤其是無(wú)法穩(wěn)定控制注射針內(nèi)的精子時(shí),應(yīng)首先檢查裝針位置和水晶螺母松緊度;當(dāng)確保裝針到位并擰緊水晶螺母后上述問(wèn)題仍未解決,應(yīng)考慮是水晶螺母內(nèi)的密封膠墊出現(xiàn)了老化或破損,需及時(shí)進(jìn)行更換;

④ 將安裝好的操作針在低倍物鏡(4×或10×)下進(jìn)行調(diào)焦,并使注射針和持卵針成一條直線;

⑤ 注射針前端角度并非與皿底完全平行,但角度不宜過(guò)大,以成功壓停運(yùn)動(dòng)精子的最小角度為佳。


04. 卵子的脫顆粒


建議卵子在透明質(zhì)酸酶中作用的時(shí)間<30 s。脫顆粒的總時(shí)間控制在1~2 min內(nèi),因此不建議一次操作過(guò)多的卵子(5~8 枚為宜)。建議使用口徑(內(nèi)徑)遞減的燒拉制成的玻璃吸管或商品化剝卵針逐步進(jìn)行卵子脫顆粒:通常先用管口燒制光滑的巴斯德吸管在酶中進(jìn)行吹吸消化、隨后用內(nèi)徑200 μm左右的吸管轉(zhuǎn)移至干凈配子緩沖液中、然后用內(nèi)徑 160~180 μm 的吸管/撥卵針進(jìn)行“粗拆”、最后用內(nèi)徑 135~140 μm的吸管/撥卵針將顆粒細(xì)胞剝離干凈;脫顆粒后的卵子應(yīng)進(jìn)行充分洗滌,最后移入卵裂培養(yǎng)液中孵育至少1 h。


05. 顯微注射基本步驟



圖2 顯微注射過(guò)程(200×)


A示輕壓精子尾部中段或下段進(jìn)行制動(dòng);B示調(diào)整 Pb1位置并固定卵子,針尖抵住透明帶后將精子移到針尖處;C示突破透明帶并刺入胞質(zhì),但此時(shí)并未破膜;D示當(dāng)胞質(zhì)瞬時(shí)流入針內(nèi)時(shí)(破膜),即刻終止負(fù)壓;E示精子進(jìn)入胞質(zhì),應(yīng)避免注入PVP


將精子注入胞質(zhì)內(nèi)是受精的關(guān)鍵。精子頭頸部順利滑出針尖,并且撤針后不隨胞膜的回彈而持續(xù)后移,即標(biāo)志著精子成功注入胞質(zhì)。當(dāng)觀察到破膜成功,但精子在注入時(shí)明顯受阻而依然停留在針尖內(nèi)側(cè),并且在撤針后精子會(huì)沿穿刺通道緩慢向外移動(dòng),表明回吐的胞膜“褶皺”阻礙了精子的進(jìn)入。如遇此種情況,可以進(jìn)行二次回吸胞質(zhì),然后再重新注入精子;或者平行于第一次穿刺通道位置進(jìn)行二次穿刺,重新破膜后再注入精子。經(jīng)過(guò)第一次穿刺拉伸后的胞膜,通常在二次穿刺時(shí)僅需輕微負(fù)壓甚至無(wú)需負(fù)壓即可破膜。推薦在200 ×~400 ×放大倍數(shù)下進(jìn)行精子的制動(dòng)和卵子的注射。


06. 精子的制動(dòng)


對(duì)于精子的制動(dòng),成功阻止前向運(yùn)動(dòng)及尾部擺動(dòng)即可;精子制動(dòng)后盡快進(jìn)行注射,不建議提前制動(dòng)足夠數(shù)量的精子后再進(jìn)行注射。對(duì)于極重度少精患者,為避免卵子外界暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可以提前抓取足夠數(shù)量的精子,但不提前進(jìn)行制動(dòng)。


07. ICSI 過(guò)程中極體擺放的位置


建議將 Pb1 置于 12 點(diǎn)或 6 點(diǎn)位置,于3點(diǎn)或9點(diǎn)位置(左手進(jìn)針者)進(jìn)行穿刺。使用顯微注射針輕壓卵子透明帶,使Pb1旋轉(zhuǎn)至穿刺焦距平面最清晰位置。


08. 注射針穿刺深度


建議穿刺深度為胞質(zhì)直徑的1/2~2/3為宜。但對(duì)于發(fā)生突然破膜(無(wú)穿刺漏斗形成)的卵子則不建議繼續(xù)進(jìn)針,可直接將精子注入胞質(zhì)。


04 受精觀察



盡管有研究報(bào)道,通過(guò) PGT 篩選正常雙親二倍體胚胎可以獲得健康嬰兒,但考慮到較低的正常胚胎率和較高的檢測(cè)成本,建議丟棄ICSI-1PN 來(lái)源的胚胎。ICSI-0PN 來(lái)源的胚胎可能是原核出現(xiàn)過(guò)早或過(guò)晚而錯(cuò)過(guò)了觀察時(shí)間。鑒于高質(zhì)量 ICSI-0PN 來(lái)源的胚胎具有與 ICSI-2PN 來(lái)源胚胎近似的正常染色體發(fā)生率、雙親二倍體比例以及妊娠結(jié)局,建議對(duì)高質(zhì)量 ICSI-0PN來(lái)源胚胎行囊胚培養(yǎng),形成可利用囊胚,經(jīng)充分知情同意后再行移植或冷凍保存。


05 ICSI特殊情況的應(yīng)對(duì)及其他細(xì)節(jié)



01. 第一次減數(shù)分裂(MⅠ)


中期卵子的處理


對(duì)于卵子成熟率較低(<50%)或高齡(≥40歲)的患者,可對(duì) MⅠ卵進(jìn)行短時(shí)間的體外培養(yǎng)(取卵后8 h內(nèi)),從而增加卵子利用率及可用胚胎數(shù)量,但鑒于其較高的非整倍體率及不良妊娠結(jié)局,有條件的可酌情對(duì)形成的囊胚進(jìn)行PGT-A檢測(cè)。


02. 易退化卵子的應(yīng)對(duì)


脫顆粒過(guò)程中應(yīng)避免高頻率、大幅度吹吸,剝卵針內(nèi)徑不應(yīng)<135 μm;避免過(guò)度剝離顆粒細(xì)胞,殘余顆粒細(xì)胞不影響卵子的觀察和注射即可;當(dāng)出現(xiàn)精子或胞質(zhì)黏針嚴(yán)重時(shí),應(yīng)及時(shí)更換ICSI針;ICSI針前端水平角度不宜過(guò)大;對(duì)于卵膜脆性較高的卵子,建議適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間,再行ICSI。


03. 無(wú)透明帶卵子的處理



圖3 人類無(wú)透明帶卵子行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射及胚胎發(fā)育情況


A示固定卵子;B示穿刺胞膜;C示注入精子;D示第1天正常受精;E示第3天 8-細(xì)胞胚胎;F示第5天囊胚


ICSI過(guò)程中,Holding針負(fù)壓不宜過(guò)大,ICSI針刺入不宜過(guò)淺;由于觀察不到 Pb1,有條件的可以利用偏振光顯微鏡確認(rèn)紡錘體位置后再行 ICSI;ZFOs 來(lái)源的卵裂期胚胎在移植或冷凍過(guò)程中容易發(fā)生解體,因此建議進(jìn)行囊胚培養(yǎng);為避免養(yǎng)囊換液過(guò)程中卵裂球分解,可以直接將培養(yǎng)微滴中的卵裂期培養(yǎng)液移除并重新注入囊胚培養(yǎng)液,或者使用一步培養(yǎng)液;建議對(duì) ZFOs 進(jìn)行單滴培養(yǎng)或應(yīng)用時(shí)差成像系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。


04. ICSI完全受精失敗的應(yīng)對(duì)


AOA 應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用,建議對(duì)前次 ICSI受精完全失敗或受精率低下的患者進(jìn)行患者精子與供者卵子的交叉試驗(yàn)、鼠卵激活試驗(yàn)(MOAT)或精子的PLC ζ染色,來(lái)判斷

精源性或是卵源性O(shè)AD;可對(duì)Ⅰ型圓頭精子癥或精源性O(shè)AD的病例進(jìn)行AOA治療;常用化學(xué)法激活劑包括離子霉素、A23187以及氯化鍶。三者之間的效果比較尚存爭(zhēng)議,但對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用上述3種激活劑臨床治療效果不佳的患者,可嘗試聯(lián)合應(yīng)用。


05. 完全不活動(dòng)精子的應(yīng)對(duì)


ICSI過(guò)程中,將完全不活動(dòng)精子中的活精子和死精子進(jìn)行區(qū)分至關(guān)重要,因?yàn)樗谰訜o(wú)法激活卵子而發(fā)生正常受精。常用的存活精子鑒別方法包括人工精子激活(ASA)、低滲膨脹試驗(yàn)(HOST)、激光輔助不動(dòng)精子選擇(LAISS)、精子尾部柔韌性測(cè)試(STFT)。


雖然上述四種方法存在各自的優(yōu)缺點(diǎn),但I(xiàn)VF實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少采用其中一種用于不動(dòng)精子的ICSI處理;鑒于ASA的安全性尚不明確,因此應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用;HOST和LAISS可以作為ASA無(wú)效病例的備選方法,但尚無(wú)證據(jù)表明兩者哪個(gè)更具優(yōu)勢(shì),可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室操作習(xí)慣及設(shè)備條件進(jìn)行選擇應(yīng)用;STFT方法通??梢越Y(jié)合HOST和LAISS方法使用。


當(dāng)使用 HOST時(shí),精子在低滲液中暴露時(shí)間應(yīng)少于 30 s。



06. 精子的優(yōu)選


目前還沒(méi)有可靠的技術(shù)可以徹底篩除 DNA 碎片化的精子,并且這些技術(shù)的安全性和有效性有待商榷,因此不建議將上述方法進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用;對(duì)于精子DNA 碎片指數(shù)(DFI)>20%~30% 且具有不良預(yù)后因素(高齡、卵巢功能低下、反復(fù)種植失敗/流產(chǎn))的病例可以嘗試上述方法進(jìn)行精子的優(yōu)選,但由于相關(guān)研究缺乏前瞻性和隨機(jī)性,因此目前尚無(wú)法推薦好的精子優(yōu)選技術(shù);若DFI持續(xù)較高且反復(fù) ICSI 周期失敗2次以上可考慮從睪丸中獲取精子。


07. 其他細(xì)節(jié)


(1)卵子孵育、脫顆粒及ICSI時(shí)機(jī)的選擇:

取卵后 2~6 h 或人絨毛膜促性腺激素(hCG)扳機(jī)后 38~42 h 內(nèi)進(jìn)行脫顆粒及 ICSI;建議脫顆粒后孵育 1 h再行ICSI;預(yù)后不良的患者可以利用紡錘體觀測(cè)儀評(píng)估卵子核-質(zhì)同步性,對(duì)于未見(jiàn)紡錘體的 MⅡ卵可以適當(dāng)延后ICSI時(shí)間。


(2)PVP的濃度:

建議根據(jù)個(gè)人技術(shù)能力和習(xí)慣將PVP進(jìn)行適當(dāng)稀釋,5%的PVP是很好的選擇,一方面降低高濃度PVP對(duì)卵子發(fā)育潛力的負(fù)面影響,另一方面也幾乎不增加精子制動(dòng)操作的時(shí)長(zhǎng)。


(3)透明質(zhì)酸酶的濃度:

商品化透明質(zhì)酸酶(80 U/mL)可以直接應(yīng)用。同時(shí)建議在不影響脫顆粒效果和時(shí)間的前提下可以進(jìn)行稀釋應(yīng)用。


質(zhì)控指標(biāo)


根據(jù)2017年維也納共識(shí)及2018年中國(guó)胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵指標(biāo)質(zhì)控專家共識(shí),將ICSI實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控指標(biāo)的計(jì)算方式及標(biāo)準(zhǔn)歸納如下,詳見(jiàn)表1。



注:正常受精率和卵子退化率為關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo);1PN率為一般質(zhì)控指標(biāo);退化卵子定義為ICSI過(guò)程中出現(xiàn)胞質(zhì)崩解及受精觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡的卵子;ICSI示卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射;PN示原核;Pb示極體


① 新人要充分了解ICSI的理論基礎(chǔ)及影響因素。只有熟練掌握撿卵、胚胎轉(zhuǎn)移、卵子脫顆粒等基礎(chǔ)技能的新人才可以開(kāi)始訓(xùn)練 ICSI 操作;

② 訓(xùn)練期間可以使用未受精或廢棄的IVM卵子進(jìn)行練習(xí)。當(dāng)新人的平均每卵操作時(shí)間(從制動(dòng)精子開(kāi)始,至注射結(jié)束)與帶教胚胎學(xué)家相當(dāng)、廢棄IVM 卵子受精率>60%、卵子退化率<10% 時(shí),方可進(jìn)行患者卵子的操作;

③ 新人在正式操作患者卵子初始階段,可以注射獲卵數(shù)較多患者(>10枚卵子)的部分卵子。至少注射 50 枚卵子后,當(dāng)受精率及卵子退化率與胚胎學(xué)家注射的同批卵子結(jié)果相當(dāng)時(shí),方可進(jìn)行獨(dú)立操作。

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